Ο Άγιος Απόστολος Τιμόθεος γεννήθηκε στα Λύστρα της Λυκαονίας από Έλληνα πατέρα και Ιουδαία μητέρα, την Ευνίκη. Έμεινε πολύ μικρός ορφανός από πατέρα και η γιαγιά του, η Λωίδα, τον ανέθρεψε «εν παιδεία και νουθεσία Κυρίου». Όταν ο απόστολος Παύλος επισκέφθηκε τα Λύστρα, εκτιμώντας τα πνευματικά του χαρίσματα και το φλογερό ιεραποστολικό του ζήλο, τον διαπαιδαγωγεί κατάλληλα και τον παίρνει συνοδό του στην Β΄ αποστολική περιοδεία όπου ζει όλες τις περιπέτειες του κορυφαίου αποστόλου για τη διάδοση του Ευαγγελικού μηνύματος. Μετά το μαρτυρικό θάνατο του Παύλου, επιστρέφει στην Έφεσο και συνεχίζει την ιεραποστολική του δράση.
Κατά τη διάρκεια μίας ειδωλολατρικής εορτής της Αρτέμιδος της Εφέσου, υπέστη άγριο ξυλοδαρμό και μαρτυρικό θάνατο από τον εξαγριωμένο ειδωλολατρικό όχλο επειδή κατέκρινε τα όργιά τους.
Το σκήνωμά του μεταφέρθηκε το έτος 356 μ.Χ. επί Κωνσταντίου στην Κωνσταντινούπολη, στο ναό των Αγίων Αποστόλων. Αποτμήματα του Ιερού Λειψάνου του Αγίου βρίσκονται στις Μονές Παντελεήμονος Αγίου Όρους, Αγίας Λαύρας Καλαβρύτων, Κύκκου Κύπρου, στο Κοπτικό Πατριαρχείο της Αιγύπτου και στο Ναό του Αγίου Γεωργίου των Ἑλλήνων Βενετίας. Η Ορθόδοξη Εκκλησία τιμά τη μνήμη του Αγίου στις 22 Ιανουαρίου.